09 abril, 2010

Como evitar los falsos negativos en la PCR?

La Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR, es la técnica más usada en Biología Molecular. Esta técnica consiste en multiplicar millones de veces una determinada región genética (un gen, un microsatélite, un marcador molecular, una región conservada, etc.) valiéndose del mecanismo de replicación de ADN, usando una enzima capaz de hacerlo a altas temperaturas. Este proceso es altamente sensible, y basta la presencia de un ADN que no corresponda a nuestra muestra (contaminación de ADN) para que aparezcan los falsos positivos.

A todos se nos ha contaminado alguna vez nuestros blancos —que en teoría son blancos, no deben amplificar ninguna secuencia de ADN. Obtener falsos positivos nos lleva a dar falsas conclusiones y malas interpretaciones, así que evitar esto es de suma importancia al trabajar con muestras de ADN.

PCRIzquierda: Blanco limpio. Derecha: Blanco contaminado. a123: Muestras M: Marcador 100pb, B: Blanco.

El primer paso es preparar nuevamente nuestras diluciones y alícuotas de todos los reactivos usados en la PCR (Búffer de PCR, MgCl2, dNTPs, Primers y Taq Polimerasa), porque nosotros no sabemos como habrán trabajado anteriormente, tal vez las diluciones que dejaron están contaminadas con ADN, así que es mejor desconfiar y preparar nuestro propio material. Es importante tener diluciones exclusivas para cada tipo de trabajo, no usar las mismas alícuotas para amplificaciones diferentes. Por ejemplo, si trabajamos con marcadores moleculares en maíz y en papa, tener alícuotas exclusivas para el maíz y alícuotas exclusivas para la papa.

El segundo paso es tener un área adecuada para mezclar los reactivos de la PCR. Ésta debe estar separada de la zona donde se hace la extracción del ADN o, si no es así, estar completamente cerrada por todos sus lados, con una pequeña puerta que se abrirá sólo en el momento de trabajo (una cabina de PCR) y equipada con una fuente de luz UV. Mantener encendida la luz UV por 15 minutos con todos los materiales dentro (micropipetas, tips, tubos de dilución y de PCR, guantes, agua, etc) —NO LOS REACTIVOS— lograremos descomponer el ADN que pueda estar presente en la cabina y que pueda contaminar nuestra PCR.

Si no tenemos una cabina de PCR, debemos tener una cámara de flujo laminar en otro ambiente diferente a donde se hace la extracción de ADN. Para esto debemos descontaminar la cámara de todo resto de ADN. Para esto se ha demostrado que el uso de Lejía es lo más efectivo. Para eso prepararás lejía a una concentración de 0.05 a 0.5%, diluyendo la lejía comercial (~5.85%) con agua pura (destilada, desionizada o MilliQ mejor, NO CON AGUA DE CAÑO). Las sales del agua potable interactúan con el cloro y le hacen perder su efectividad. Como podemos ver, hacemos una dilución de 1/100 ó 1/10 y la ponemos en un rociador o pulverizador (como lo que usan los peluqueros) y espolvoreamos sobre la zona de trabajo y los materiales que usaremos. Dejamos que actúe la lejía por 15 minutos, luego secamos todo con un papel absorbente. Es común que los materiales con el tiempo se blanqueen, ya que la lejía es corrosiva, pero no se preocupen, no se descascararán o romperán porque la concentración no es alta, solo se blanquearán. Si quieren evitar esto, deben tener una cámara de PCR con luz UV o comprar una sustancia eliminadora de ADN como el DNACleaner® y aplicarlo sobre el área de trabajo y los materiales, aunque es algo mucho más costoso. Se ha demostrado que la mejor dilución es 1/20 (~0.1%) y que el HCl 2N no sirve para la descontaminación de ADN (ver A. M. Prince, L. Andrus PCR: Biotechniques 1992 Mar;12(3):358-60).

Mientras esperamos los 15 minutos, podemos sacar los reactivos del congelador, (menos la Taq Polimerasa). Si usamos una Taq Polimerasa HotStart, no es necesario picar hielo, porque podemos hacer el MasterMix (mezcla de todos los reactivos de la PCR) a temperatura ambiente. Yo recomiendo comprar una enzima HotStart, la diferencia en el precio no es mucha y las ventajas que se obtienen, sin dudas, compensan toda esta diferencia en el precio. Por ejemplo: Las Taq Polimerasa comúnmente usadas son Promega (GoTaq) o Fermentas, las cuales en el Perú cuestan aproximadamente S/.110 [1$ = S/.2.84] por 100U (de 500U aproximadamente S/.475) y una HotStart como la Platinum® de Invitrogen está S/.650 de 500U (de repente ha bajado), esos ~S/.200 de más te ahorran mucho tiempo al preparar el Master Mix, picar hielo que puede tener contaminantes y se vuelve fastidioso cuando empieza a derretirse, menos tiempo de preparación del Master Mix, menos probabilidad de contaminación y además es una Taq Polimerasa más específica y eficiente que una normal.

Y el último paso para evitar la contaminación con ADN es usar Tips con filtro (antispray) para preparar nuestro Master Mix. Si no tenemos presupuesto para comprar estos tips, usemos micropipetas exclusivas para PCR (no usar esas micropipetas con otra cosa que no sea con los reactivos de la PCR), y nunca usemos tips reciclados. Luego procedemos a poner el Master Mix en los tubitos de PCR y los cerramos. Llevamos los tubitos a otro ambiente par cargar el ADN y sólo los abriremos para eso, antes y después de cargar el ADN los tubitos deben permanecer cerrados, el trabajo se hace un poco tedioso, pero así evitaremos contaminar nuestra PCR. Si tenemos micropipetas multicanal, nos ahorraremos más tiempo.

También debemos recordar usar un mandil exclusivo para la preparación del Master Mix, así como guantes nuevos (no importa que no sean de nitrilo). Los mandiles deben lavarse por lo menos una vez a la semana con lejía (de paso lo dejamos bien blanquitos).

Una vez terminado el trabajo, repetir la limpieza de todos los materiales usados en la presente PCR con lejía, tal como lo describimos al inicio de este artículo.

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